Визначення концентрації глюкози в крові — одне з найбільш часто виконуваних біохімічних досліджень в лабораторіях.
глюкозооксидазного метод визначення в і підстави на реакції окислення глюкози в присутності ферменту глюкозооксидази з утворенням перекису водню, яка в свою чергу в присутності пероксидази окисляє ОРТОТОЛИДИН з утворенням забарвлених продуктів, про концентрацію глюкози обіцяють за кількістю забарвлених продуктів.
Оскільки глюкозооксидазний метод спрямований на виявлення саме глюкози, а не всіх видів цукрів, його застосовують в диференціальної діагностики таких захворювань:
Принцип глюкозооксидазного методу визначенняглюкози
Глюкоза в присутності ферменту глюкозооксидази окислюється киснем повітря з утворенням в ході реакції перекису водню. Перекис водню в присутності ферменту пероксидази окисляє ортотолуідін утворенням забарвленого з'єднання, інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту глюкози. Даний метод дозволяє визначити рівень глюкози в плазмі крові, сироватці та .
Нормальний вміст глюкози в крові, ммоль / л
— в плазмі, натщесерце
- новонароджені — 1,7 — 4,2
- діти від 6 тижнів до 15 років — 3,3 — 5,4
- дорослі (чоловіки, жінки) — 3,9 — 5,6
— в сироватці крові, натщесерце
- новонароджені — 2,6 — 4,2
- діти від 6 тижнів до 2 років — 3,3 — 5,4
- дорослі (чоловіки, жінки) — 3,9 — 5,6
Необхідні реактиви для визначення глюкози глюкозооксидазним методом
1. Натрію хлориду 9 г / л (ізотонічний розчин): готують, розчиняючи 0,9 г NaCl в 100 мл води.
2. Цинку сульфат, 50 г / л: 5 г сульфату цинку (ZnSO4) розчиняють у воді, об'єм доводять до 100 мл.
3. Натр їдкий, 0,3 моль / л: готують, розчиняючи 1,2 г NaOH в 100 мл води, концентрацію перевіряють титруванням (вона повинна бути 0,3 н).
4. Ортотолуідін, 1% -ний розчин: 1 г препарату розчиняють в 100 мл абсолютного спирту. Розчин можна зберігати в холодильнику в склянці з притертою пробкою кілька місяців. Наявний у продажу препарат можна очистити перекристаллизацией, для чого його розчиняють в абсолютному спирті, додають воду і випали кристали відсмоктують на фільтрі, потім сушать над хлоридом .
5. Ацетатний буферний розчин рН 4,8: змішують 4 частини 0,25 н оцтової кислоти (перевірити титруванням) і 6 частин 0,25 н ацетату натрію (містить 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 літрі).
6. Глюкозооксидаза — сухий препарат активністю 3000 од / мг або більше.
7. Пероксидаза з хрону. 1 мг розчиняють в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнику можна зберігати кілька днів.
8. Робочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера розчиняють 2 мг глюкозооксидази і 1 мг пероксидази, додають 1 мл 1% -ного розчину ортотолуідіна, перемішують і доводять обсяг буферним розчином до 100 мл. Робочий реактив повинен бути прозорим, безбарвним або мати слабо-зелений відтінок, в цьому випадку він стійкий при зберіганні на холоді. Якщо ж забарвлення інтенсивна або через кілька годин після приготування починає випадати осад, це означає, що ортотолуідін недостатньо чистий і його треба перекристалізованої.
9. Калібрувальні розчини глюкози. Глюкозу попередньо висушують при температурі 37 ° С і зберігають в ексикаторі. Спочатку готують основний розчин з концентрацією 50 ммоль / л, для чого 180 мг речовини розчиняють в 20 мл насиченого розчину (приблизно 0,3% -ного) бензойної кислоти. З цього розчину готують робочі калібрувальні розчини, які містять 3, 6, 9, 12, 15, 18 і 21 ммоль / л, для чого беруть 0,6, 1,2, 1,8, 2,4, 3, 3,6 і 4,2 мл основного розчину і доводять насиченим розчином бензойної кислоти до об'єму 10 мл. Ці розчини містять глюкозу в тих же концентраціях, у яких вона буває в крові, що полегшує розрахунки при калібрування.
Хід визначення глюкози глюкозооксидазним методом
У центрифужні пробірки вносять 1,1 мл розчину хлориду натрію, 0,4 мл розчину сульфату цинку і 0,4 мл 0,3 н розчину NaOH, перемішують, при цьому утворюється дуже тонкий гель гідрату окису цинку, в нього випускають 0,1 мл крові або каліброваного розчину, знову перемішують і через 10 хвилин центрифугують при швидкості 3000 об. / хв протягом 10 хвилин.
до 1 мл надосадової рідини додають 3 мл робочого реактиву і обережно перемішують.
Поступово починає розвиватися забарвлення, яка при звичайній кімнатній температурі досягає максимуму через 13-15 хвилин, а потім поступово зменшується. Фотометрують завжди через один і той же проміжок часу після додавання робочого реактиву в кюветах з довжиною оптичного шляху 1 сантиметр з червоним світлофільтром (довжина хвилі 625 нм) проти холостого досвіду, який ставлять одночасно з робочими пробами, але замість крові беруть фізіологічний розчин натрію.
При приготуванні каліброваного графіка замість проб крові беруть 0,1 мл відповідного калібрувального розчину.
Розрахунок рівня глюкози можна проводити за правилом пропорцій або по каліброване графіком, для побудови якого на одній осі відкладають концентрацію глюкози (ммоль / л), а на іншій — величину екстинкції.
Примітки до методика визначення глюкози глюкозооксидазним методом
1. Можна спочатку випустити кров з піпетки в ізотонічний розчин хлориду , а потім додати розчини сульфату цинку і NaOH.
2. При систематичній роботі немає необхідності постійно будувати калібрувальний графік по всіх точках, достатньо щодня обробляти холосту пробу і 2-3 точки в діапазоні 3-9 ммоль / л, а повний калібрувальний графік будувати лише при зміні реактивів або налагодженні методики.