Аналізи

Трансплантація стовбурових клітин при патології центральної нервової системи

З'ясування можливостей і обмежень використання стовбурових клітин для клітинної терапії патології центральної нервової системи людини — одна з основних задач в дослідженні мультіпотентних стовбурових клітин мозку.

Трансплантація фетальних тканин і клітин використовується протягом більше 30 років в експериментальних дослідженнях і при лікуванні захворювань центральної нервової системи людини. Один із перспективних напрямів нейротрансплантації — внутрішньомозковий введення ембріональних стовбурових клітин, нервових стовбурових клітин і клітин-попередників. Пов'язано це з тим, що ранні ембріональні мультипотентні клітини мають більш високими потенціями інтеграції з мозком реципієнта, зберігаючи здатність до проліферації, міграції та термінальної диференціації.  Істотно також те, що є можливість клонування ембріональних стовбурових клітин, нервових стовбурових клітин, клітин-попередників, їх спрямованої генетичної модифікації і попередньої диференціації, що дозволяє створювати значні обсяги нативного і генноїнженерного клітинного матеріалу для експериментальної і клінічної нейротрансплантації.

Встановлено, що популяція нейтральні клітин-попередників, виділених з мозку ембріонів людини, збільшується при культивуванні в середовищі, що містить EGF, bFGF і LIF в 10 млн разів, не втрачаючи при цьому здатності до спрямованої міграції та диференціації в нервові і гліальні клітини при подальшої трансплантації в мозок дорослих щурів.

Терапевтичний ефект виявлено при внутрішньомозкової трансплантації ембріональних стовбурових клітин, нервових стовбурових клітин і клітин-попередників при різних формах експериментальної патології центральної нервової системи. Пов'язано це з унікальною здатністю спрямованої міграції клітин-попередників не тільки до місць термінальної диференціації, але і до патологічного вогнища. Наприклад, при створенні локального вогнища фотоіндукованого апоптозу нейронів кори мозку мишей мультипотентні клітини-попередники миші формують диференційовані нейрони переважно в місці нейрональної загибелі.

При гліома мозку щурів трансплантовані нейрональні стовбурові клітини мігрують до пухлини і локалізуються по її периферії. Цікаво, що спрямована міграція відбувається не тільки при імплантації стовбурових клітин в місці локалізації пухлини, а й при введенні цих клітин в віддалені від неї ділянки ипсилатеральной кори, і навіть в протилежну півкулю або в шлуночки мозку. Більш того, нервові стовбурні клітини були виявлені в місці локалізації пухлини після внутрішньовенного введення нейрональних стовбурових клітин.

Виходячи з цього, представляється можливим використовувати нервові стовбурні клітини в нейроонкології для цілеспрямованого транспорту протипухлинних препаратів, наприклад цітозіндезамінази.

Лікування дитячої онкології в Ізраїлі проводиться не тільки традиційними методами — хірургічним, хіміотерапією та іншими, а й із застосуванням клітей пуповинної крові, як аутогенних так і алогенних.

Внутрішньомозкова трансплантація щурам клітин-попередників, експрессірующіх інтерлейкін-4, призводить до поступового зникнення пухлини. Трансплантовані клітини-попередники, мічені BrdU, зберігаються протягом декількох тижнів.

Перспективним також є застосування клітинної терапії в лікуванні різних форм демієлінізуючих захворювань. У зв'язку з цим інтерес представляють результати трансплантаційної терапії генетично зумовленого дісміеліногенеза у мутантної лінії мишей shiverer, у яких порушена міелінообразующая функція олигодендроцитов. При внутрижелудочковой трансплантації новонародженим мишам цієї лінії клонованих стовбурових клітин відбувається заміщення дефектних олигодендроцитов на міелінобразующіе клітини олігогліі, які De novo формують мієлінові оболонки. Підтвердженням цього служить часткове або повне зникнення тремору, основного симптому ураження центральної нервової системи у мишей лінії shiverer.

Клоновані клітини-попередники олигодендроцитов трансплантували також в спинний мозок нормальних і новонароджених щурів. Використано клітини, що містять ген Lac Z і клітини, які експресують? -галактозідазу (LacZ +). У спинному мозку md щурів трансплантовані клітини мігрували по аксональним трактах на відстань 7 мм (Lac Z) і 12 мм (Lac Z +) від місця введення і утворювали нормальні мієлінові оболонки.

нейтральні клітини-попередники субвентрікулярной зони дорослих мишей мігрують до вогнища демієлінізації в мозолисте тілі, викликаної локальним введенням лізолецітіна, і трансформуються в олігодендроціти і астроцити. Ці клітини експресують ембріональні форми молекул клітинної адгезії нейтральні клітин, пов'язані з полісіаловой кислотою (PSA-NCAM).

PSA-NC AM-позитивні клітини складають понад 90 % Клітин нейросфер, отриманих з клітин мозку ембріона. У разі культивування нейросфер на адгезивному субстраті відростки нервових клітин формують зону росту, в якій зміцнюються PSA-NCAM — позитивні клітини, які експресують антигени, характерні для олігогліі.

нейросфер, збагачені PSA-NCAM-позитивними клітинами-попередниками олигодендроцитов, отримали назву «олігосфери». При трансплантації олігосфер в мозок новонародженим мишам лінії shiverer клітини-попередники дають початок клітинам, що формує мієлінові оболонки аксонів. Отже, олігосфери можуть бути матеріалом для трансплантації при демієлінізуючих захворюваннях центральної нервової системи.

тотипотентних ембріональні стовбурові клітини також можуть бути джерелами клітин-попередників астроцитів і олигодендроцитов. Клонування їх в середовищах, що містять комплекс ростових факторів (GFG2, EGF, PDGF), дає можливість отримати изоморфную популяцію клітин-попередників глії. При відсутності таких чинників в культуральному середовищі ці клітини диференціюються в астроцити і олігодендроціти.

Введення клітин-попередників глії, отриманих з ембріональних стовбурових клітин, в спинний мозок 7-денних щурів, у яких порушена миелинизация волокон, призводило до локального утворення мієлінових волокон. Міграція трансплантованих клітин обмежувалася 2 мм. При внутрижелудочковой трансплантації клітин-попередників глії 17-денним ембріонам щурів цієї лінії міелінізірованние волокна виявляли в різних областях головного мозку (мозолисте тіло, передня коміссуру, неокортекс, гіпокамп, тектум, таламус і гіпоталамус). Можливість трансепендімной міграції міелінобразующіх клітин вказує на розробку в перспективі клінічних методів внутрішньомозкової і внутрішньошлуночкової клітинної терапії спадкових демієлінізуючих захворювань в ранньому дитячому віці.

При гіпоксичної ішемії нейротрофічний ефект трансплантації ембріональних нервових клітин полягає в стимуляції процесів регенерації в центральній нервовій системі і зниженні кількості пошкоджених нейронів в корі головного мозку дорослих щурів.

фокальної ішемії мозку щурів викликали закриттям середньої мозкової артерії. Як трансплантатів використовували мультипотентні нейтральні стовбурові клітини, отримані з клонів ембріональних стовбурових клетокітератокарціноми людини, в тому числі клітини лінії NT2N. Імплантували в стриатум як нативні, так і кріоконсервовані клітини на тлі імуносупресивної терапії. Через 1 місяць після трансплантації значно покращилася рухова активність щурів в порівнянні з контрольними ложнооперірованнимі тваринами.

Встановлено, що більше половини трансплантованих стовбурних клітин кісткового мозку мігрують в півкуля мозку, де знаходиться ішемічний вогнище. Кількість астроцитів зростає в 1,5 рази в порівнянні з контрлатеральний півкулею. Передбачається, що трансплантація стовбурових клітин кісткового мозку може бути використана для лікування захворювань центральної нервової системи.

Досліджувалися морфологічні та поведінкові ефекти трансплантації нейтральні стовбурових клітин (лінії МНР36), виділених з гіпокампу 14-денних ембріонів. МЕ1Р36-клітини імплантували над пошкодженим полем СА1 гіпокампу. За даними гістологічних досліджень, трансплантовані клітини мігрували в зону пошкодження, відновлювали структуру поля СА1 і диференціювалися в зрілі нервові і гліальні клітини, що призводило до відновлення порушених когнітивних і поведінкових функцій. Аналогічні результати отримані при імплантації МНР36 в гіпокамп мавп-мармозеток після цитотоксичної пошкодження поля СА1 гіпокампу, а також у щурів після цитотоксичної пошкодження холінергіческіх структур переднього мозку. У всіх випадках трансплантація клітин МНР36 супроводжувалася відновленням структури і функцій пошкоджених утворень мозку.

У ряді досліджень проводили трансплантацію стовбурових клітин при експериментальній моделі хвороби Паркінсона. L. Studer et al. (1998) використовували клітини-попередники, виділені з вентрального відділу середнього мозку 12-денних ембріонів щурів. Вони культивували проліферуючі клітини в бессивороточной середовищі, що містить FGF2 протягом 1 тижня. В подальшому проводили роллерного культивування нейросфер і диференціацію клітин-попередників в дофамінергічних нейрони після видалення ростового фактора. Такий підхід дозволяв отримувати 30-кратне збільшення кількості клітин. Амфетамінового проби показали, що клітини нейросфер, трансплантовані в стриатум щурів, компенсували порушення локомоторной активності тварин, викликані одностороннім пошкодженням дофамінергічних нейронів чорної субстанції 6-гідроксідофаміном.

В умовах експериментальної моделі Паркінсона проводилася трансплантація плюрипотентних клітин тератокарціноми людини в чорну субстанцію і стриатум. Ці клітини активно проліферіровать, проте кількість нейронів, екснрессіруюгціх тирозингідроксилази було недостатнім для відновлення функції нігростріарной системи.

При експериментальному паркінсонізмі у щурів для внутрістріарной трансплантації використовували також мультипотентні генетично модифіковані стовбурові клітини кісткового мозку щурів і людини (трансдукція генів, що кодують тирозингідроксилази і гуанозінтріфосфатцргклогідролазу — фермент, необхідний для вироблення кофактора тирозингідроксилази). Генетично модифіковані клітини синтезували L-DOPA In vitro і при трансплантації в стриатум в значній мірі знижували рівень функціональних порушень за результатами амфетамінової проби.

Для лікування експериментального паркінсонізму щурів запропонована стимуляція проліферації, спрямованої міграції та диференціації «покояться» стовбурових клітин зрілого мозку. При односторонньому пошкодженні 6-гідроксідофаміном дофамінергічних нейронів чорної субстанції і вентральної сегментальной області вводили в іпсілатеральний стриатум трансформуючий фактор росту (TGFa) через вживлену канюлю за допомогою мікроінжектора.

За даними гістологічних досліджень, в субвентрікулярной зоні стриатума і тільки на стороні пошкодження активно проліферують стовбурові клітини і генеруються нейрональні клітини-попередники, які мігрують в область TGFa, де формують зрілі нейрони. Через 3-4 тижні після операції в поведінці тварин спостерігали значне поліпшення локомоторною функції за показниками апоморфіновой обертальної проби. Передбачається, що спостережуваний ефект пов'язаний саме з TGFa, так як у хворих паркінсонізмом незначно підвищується рівень ендогенного TGFa. Можливо, внутрішньомозкова інфузія TGFa знайде клінічне застосування в лікуванні паркінсонізму та інших форм патології центральної нервової системи.

Зроблено також спроби трансплантації клонованих нейтральні клітин-попередників людини щурам, у яких моделювали хорею Гентінтона. Велика частина трансплантованих клітин дифференцировалась і експресуватися нейральні антигени, в тому числі DARPP-32 — інгібітор фосфатази, що міститься в дофамінергічних нейронах. Спостерігався диференційований зростання аксонів цих нейронів в мозку реципієнта без вираженої специфічності формуються зв'язків.

Для трансплантації використовували також лінійні нейральні постмітотичні клітини тератокарціноми людини (NTera-2), які диференціювалися під дією ретиноєвої кислоти і були подібними за біохімічними показниками з нейронами стриатума. Клітини NTera-2 трансплантували в стриатум щурів при його односторонньому пошкодженні хіноліновий кислотою. Щурам контрольної групи вводили тканину ембріонального стриатума. При порівнянні встановлена ​​рівна ступінь відновлення порушених рухових функцій. Отримані результати свідчать про перспективність генноінженерних технологій в створенні клітин із заданими параметрами, необхідними для клітинно-трансплантаційної терапії захворювань центральної нервової системи.

Ряд експериментальних досліджень присвячений вивченню терапевтичного ефекту трансплантуються стовбурових клітин при травмі головного мозку. Так, нативні або кріоконсервовані клітини NTera-2 вводили в зону механічного пошкодження кори головного мозку щурів. Гістологічні дослідження, проведені через 2 і 4 тижні, показали високу виживаність трансплантованих клітин, а іммуноцітохіміческіе реакції із застосуванням антитіл МОС-1, специфічних щодо молекул клітинної адгезії нейронів людини, дозволили встановити формування відростків у трансплантованих клітин і їх вростання в тканину мозку реципієнта. Однак рухові функції не відновлювалися.

При пошкодженні спинного мозку в якості трансплантата використовували ембріональні стовбурові клітини лінії ROSA26, які попередньо зазнали короткочасного впливу ретиноєвої кислоти (клітини вводили в зону контузії спинного мозку через 9 днів після нанесення травми). Через 2-5 тижнів у галузі трансплантації і на відстані 8 мм від пошкодження знаходили диференційовані олігодендроціти (43%), астроцити (19%), нейрони (8%). У тварин цієї групи спостерігали часткове відновлення координації моторних функцій задніх кінцівок.

Таким чином, результати експериментальних досліджень показали, що стовбурові клітини здатні стимулювати регенерацію пошкоджених і заміщати загиблі нейрони при гострій патології і нейродегенеративних захворюваннях центральної нервової системи. Їх можна використовувати для генної терапії, застосовуючи клоновані стовбурових клітин, які експресують продукти, необхідні для поповнення втрачених внаслідок пошкодження або захворювання нейрогуморальних факторів. Так як стовбурові клітини можна генетично модифікувати, а також, з огляду на їх здатність до спрямованої міграції в осередку ураження, передбачається їх використання в якості засобу доставки біологічно активних речовин, що стимулюють регенеративні процеси в центральній нервовій системі.

Паралельно з експериментальними дослідженнями ведуться клінічні випробування щодо можливості застосування стовбурових клітин в лікуванні захворювань центральної нервової системи. Так, в 2000 р закінчилися перші клінічні випробування з перевірки безпеки пересадки нейробластов, отриманих зі стовбурових клітин тератокарціноми NIera-1 людини. Незрілі клітини розмножували багаторазовим пассажірованіем і отримували біомасу 50-100 млн клітин. У частині клітин досліджували фенотип і відсоток домішок, відсутність контамінації вірусами і бактеріями. Потім з живильного середовища прибирали LIF і фідерний шар клітин, створюючи умови для спрямованої диференціювання ембріональних стовбурових клітин в нейрони. Склад суміші, що індукує 95% -ю диференціювання ембріональних стовбурових клітин в нейрони, фірма «БіоЛейтон» (США) не розголошує. Культуру нейробластов пропускали через проточний сортер для видалення незрілих клітин тератокарціноми. Після повторної очистки та визначення фенотипу, ретельно підготовлені клітини (10-12 млн нейробластов) за допомогою спеціальної мікроканюлі і шприца вводили під контролем стереотаксіса і комп'ютерної томографії в базальное ядро ​​мозку хворому через 6 місяців після геморагічного інсульту. Скринінг (12 місяців) наслідків трансплантації клітин в зону інсульту показав відсутність побічних небажаних ефектів в 100 % Випадків. У половини хворих розвивалося достовірне поліпшення моторної симптоматики в період 6-12 місяців після трансплантації. Позитивний клінічний ефект супроводжувався паралельним поліпшенням кровопостачання зони інсульту після трансплантації клітин. Середній приріст поглинання 2-дезоксиглюкозу (міченої флуоресцентною міткою), визначений за допомогою позитронної емісійної томографії, становив 18%, а у деяких пацієнтів сягав 35-40%. В даний час клінічні випробування проводяться також в ряді неврологічних центрів США і Європи.

Трансплантацію фетальних експлантатов в substatia nigra для локального заміщення втрачених ДОФА-ергічних нейронів в мозку хворих паркінсонізмом, які страждають вираженими руховими розладами, стали використовувати ще з середини 80-х років XX ст. Попередні досліди на тваринах підтвердили необхідність спрямованої доставки в обмежену зону мозку дофаміну. Ніякої необхідності одночасного відновлення нейрональних електричних мережевих зв'язків між донорськими організаціями та реципієнтную нейронами не виставлялися в якості умов лікування. Спочатку на мишах була розроблена технологія напрацювання великої кількості ДОФА-нейронів для пересадки в путам і substatia nigra мишам з модельним паркінсонізмом. Близько половини нейронів виживали. Виявилося, що пересадка популяцій клітин-попередників, на відміну від диференційованих нейронів, дозволяє створювати паростки оновлених клітин. Клітини-попередники більш ефективно, стабільно і довгостроково доставляють дефіцитні молекули медіатора або продукт нормального алеля гена прямо в зону пошкодження.

З цієї ж причини перевагу надають технологіям вирощування мієлін-продукують олигодендроцитов з ембріональних стовбурових клітин, щоб створювати в зоні ушкодження паростки регенерації з усієї ієрархії необхідних для регенерації клітин. Спочатку розмножують ембріональні стовбурові клітини до певної кількості, достатнього для ефективної трансплантації. Потім отриману масу недиференційованих клітин направлено перетворюють в популяцію міелінпродуцірующіх попередників олигодендроцитов, які маркуються селективними антигенами. Популяції проолігодендроцітов краще використовувати для трансплантації в місце демиелинизации. Змішані популяції, що зберігають активно мігрують попередники, доцільно вводити в бічний шлуночок, так як клітини-попередники мають здатність мігрувати до вогнищ демієлінізації і механічної травми.

В експериментах на нокаут-мишах була обгрунтована концепція лікування шляхом спрямованої «хімерізаціі» хворого мозку паростками здорової нервової тканини, клітини яких інтенсивно мігрують в разі використання ранніх попередників. Зараз такий підхід широко використовується в експериментах і перших клінічних випробуваннях для корекції травми головного і спинного мозку, лікування сфірінгоміеліі, розсіяного склерозу, спадкових дефектів мозочка і іншої патології.

Похожие статьи

Додати коментар

Кнопка «Наверх»
Закрыть